Se desarrolló un nuevo método de PCR digital de gotitas (ddPCR) para detectar y cuantificar simultáneamente el ADN del VPH de diferentes tipos de VPH.
Objetivo: Probar una nueva forma de detectar y medir el virus del papiloma humano (VPH) con mayor precisión, y compararla con otra técnica ya usada, para ayudar a mejorar el diagnóstico y seguimiento de esta
Tipo de muestra biológica: Se utilizaron muestras clínicas de tejidos orales y genitales, incluyendo tejidos cancerosos y no cancerosos, para la detección de ADN del VPH.
Extracción del ácido nucleico:
La extracción de ácido nucleico (ADN) usando el kit QIAamp DNA (Qiagen) basados en el fragmento del artículo y en la información técnica de Qiagen son los siguientes:
Lisis de las células: Se realiza la lisis de las células presentes en la muestra (tejido o sangre) en condiciones desnaturalizantes a alta temperatura, utilizando una proteasa (Proteinasa K) y un tampón de lisis (AL o ATL según el protocolo). En algunos casos, se puede macerar mecánicamente el tejido para facilitar la lisis y se incuba a 56 °C por varias horas para lisar completamente el tejido.
Adición de etanol: A la mezcla de lisado se añade etanol absoluto para optimizar la unión del ADN a la membrana de la columna de sílice.
Unión del ADN a la columna: La mezcla se transfiere a una columna de centrifugación con membrana de gel de sílice. Mediante centrifugación o vacío, el ADN genómico se adsorbe a la membrana, mientras que las proteínas y otros contaminantes pasan al filtrado.
Lavado de la membrana: Se realizan uno o varios lavados con soluciones específicas para eliminar contaminantes residuales. Estos lavados se efectúan por centrifugación para arrastrar las impurezas fuera de la membrana.
Elución del ADN: Finalmente, el ADN se eluye de la membrana con un volumen adecuado de tampón de elución o agua libre de nucleasas, quedando listo para su uso en aplicaciones posteriores o para almacenamiento a −20 °C.
Precauciones para evitar contaminaciones: Durante todo el proceso se adoptan medidas estrictas para evitar contaminaciones cruzadas, incluyendo el uso de controles negativos (agua destilada sin ADN y ADN de esperma de salmón) para verificar la ausencia de contaminación durante la extracción y análisis molecular (ddPCR/qPCR)
Tipo de PCR y genes amplificados
Se empleó la técnica de PCR digital en gotas (ddPCR) para la detección y cuantificación simultánea de múltiples tipos de VPH. Se utilizaron los cebadores GP5+/GP6+, que amplifican una región conservada del gen L1 del VPH, permitiendo la detección de varios tipos del virus en una sola reacción.
Tipo de resultados: cualitativos o cuantitativos
La ddPCR proporciona resultados cuantitativos, permitiendo determinar la carga viral exacta de diferentes tipos de VPH en las muestras analizadas. Esta cuantificación es esencial para evaluar la asociación entre la carga viral y el riesgo de progresión a lesiones malignas.
Este estudio demuestra la eficacia de la ddPCR como una herramienta sensible y precisa para la detección y cuantificación de múltiples tipos de VPH en muestras clínicas, lo que puede ser fundamental para el diagnóstico y monitoreo de infecciones por VPH.
- Rotondo JC, Oton-Gonzalez L, Mazziotta C, Lanzillotti C, Iaquinta MR, Tognon M, Martini F. Simultaneous Detection and Viral DNA Load Quantification of Different Human Papillomavirus Types in Clinical Specimens by the High Analytical Droplet Digital PCR Method. Front Microbiol. 2020 Nov 19;11:591452. doi: 10.3389/fmicb.2020.591452. PMID: 33329471; PMCID: PMC7710522. Disponible en: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7710522/
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