Técnica de Western blot en enfermedad de Lyme

En este estudio se empleó la técnica de Western blot para identificar las proteínas inmunogénicas de Borrelia burgdorferi, el microorganismo responsable de la enfermedad de Lyme. Se recolectaron muestras de sangre tanto de pacientes con diagnóstico confirmado como de conejos y ratones infectados experimentalmente con la bacteria. Al analizar las respuestas inmunológicas mediante los sueros de conejos infectados, se observaron reacciones significativas contra proteínas con pesos moleculares de 31, 32.5, 34, 35, 38, 39–40, 41, 66, 83 y 93 kDa. De todas ellas, la proteína de 41 kDa —identificada como flagelina— presentó reactividad parcial, y se considera un marcador importante para el diagnóstico serológico, de acuerdo con los criterios establecidos por los CDC.

Tema:

Identificación de proteínas inmunogénicas de Borrelia burgdorferi para el desarrollo de una vacuna contra la enfermedad de Lyme.

Objetivos:

Determinar los antígenos reactivos comunes en la infección por Borrelia burgdorferi reconocidos en sueros de mamíferos que puedan ser útiles para el desarrollo de una vacuna contra la enfermedad de Lyme.

Tipo de muestra biológica:

Sueros obtenidos de pacientes humanos con enfermedad de Lyme documentada, y de conejos y ratones infectados experimentalmente con Borrelia burgdorferi.

Corte con Enzima de restricción:

No se menciona el uso de enzimas de restricción en el procedimiento descrito.

Corrido electroforético:

Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida para separar los lisados de células completas de Borrelia burgdorferi y las escaleras de proteínas.

Blotting:

Las proteínas separadas por electroforesis fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa utilizando la técnica de Western blot.

Unión con sondas:

Se utilizaron reactivos de IgG anti-HRP (fosfatasa alcalina conjugada con anti-IgG de conejo, anti-IgG humano y anti-IgG de ratón) como sondas para detectar las proteínas inmunorreactivas en las membranas.

Visualización:

Las membranas fueron visualizadas utilizando sustratos de bromo-cloro-indolilo o ECL Ultra A/B para detectar las conjugaciones de fosfatasa alcalina unidas a los anticuerpos, revelando las bandas inmunorreactivas.

Referencia bibliográfica:

1. Loomba K, Shi D, Sherpa T, Chen J, Daniels TJ, Pavia CS, et al. Use of the Western blot technique to identify the immunogenic proteins of Borrelia burgdorferi for developing a Lyme disease vaccine. Biomed Pharmacother [Internet]. 2023 [citado el 23 de junio de 2024];157(114013):114013. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36403566/

Prueba PCR para virus del papiloma humano (VPH)

Se desarrolló un nuevo método de PCR digital de gotitas (ddPCR) para detectar y cuantificar simultáneamente el ADN del VPH de diferentes tipos de VPH. 

Objetivo: Probar una nueva forma de detectar y medir el virus del papiloma humano (VPH) con mayor precisión, y compararla con otra técnica ya usada, para ayudar a mejorar el diagnóstico y seguimiento de esta 

Tipo de muestra biológica: Se utilizaron muestras clínicas de tejidos orales y genitales, incluyendo tejidos cancerosos y no cancerosos, para la detección de ADN del VPH.

Extracción del ácido nucleico: 

La extracción de ácido nucleico (ADN) usando el kit QIAamp DNA (Qiagen) basados en el fragmento del artículo y en la información técnica de Qiagen son los siguientes:

Lisis de las células: Se realiza la lisis de las células presentes en la muestra (tejido o sangre) en condiciones desnaturalizantes a alta temperatura, utilizando una proteasa (Proteinasa K) y un tampón de lisis (AL o ATL según el protocolo). En algunos casos, se puede macerar mecánicamente el tejido para facilitar la lisis y se incuba a 56 °C por varias horas para lisar completamente el tejido.

Adición de etanol: A la mezcla de lisado se añade etanol absoluto para optimizar la unión del ADN a la membrana de la columna de sílice. 

Unión del ADN a la columna: La mezcla se transfiere a una columna de centrifugación con membrana de gel de sílice. Mediante centrifugación o vacío, el ADN genómico se adsorbe a la membrana, mientras que las proteínas y otros contaminantes pasan al filtrado.

Lavado de la membrana: Se realizan uno o varios lavados con soluciones específicas para eliminar contaminantes residuales. Estos lavados se efectúan por centrifugación para arrastrar las impurezas fuera de la membrana.

Elución del ADN: Finalmente, el ADN se eluye de la membrana con un volumen adecuado de tampón de elución o agua libre de nucleasas, quedando listo para su uso en aplicaciones posteriores o para almacenamiento a −20 °C.

Precauciones para evitar contaminaciones: Durante todo el proceso se adoptan medidas estrictas para evitar contaminaciones cruzadas, incluyendo el uso de controles negativos (agua destilada sin ADN y ADN de esperma de salmón) para verificar la ausencia de contaminación durante la extracción y análisis molecular (ddPCR/qPCR)

Tipo de PCR y genes amplificados

Se empleó la técnica de PCR digital en gotas (ddPCR) para la detección y cuantificación simultánea de múltiples tipos de VPH. Se utilizaron los cebadores GP5+/GP6+, que amplifican una región conservada del gen L1 del VPH, permitiendo la detección de varios tipos del virus en una sola reacción.

Tipo de resultados: cualitativos o cuantitativos

La ddPCR proporciona resultados cuantitativos, permitiendo determinar la carga viral exacta de diferentes tipos de VPH en las muestras analizadas. Esta cuantificación es esencial para evaluar la asociación entre la carga viral y el riesgo de progresión a lesiones malignas.

Este estudio demuestra la eficacia de la ddPCR como una herramienta sensible y precisa para la detección y cuantificación de múltiples tipos de VPH en muestras clínicas, lo que puede ser fundamental para el diagnóstico y monitoreo de infecciones por VPH.

Video tomado de: https://www.youtube.com/watch?v=tXNVylRkJGU

Referencias bibliográficas:

1. Rotondo JC, Oton-Gonzalez L, Mazziotta C, Lanzillotti C, Iaquinta MR, Tognon M, Martini F. Simultaneous Detection and Viral DNA Load Quantification of Different Human Papillomavirus Types in Clinical Specimens by the High Analytical Droplet Digital PCR Method. Front Microbiol. 2020 Nov 19;11:591452. doi: 10.3389/fmicb.2020.591452. PMID: 33329471; PMCID: PMC7710522. Disponible en: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7710522/

Técnica de secuenciación para la fibrosis quística

La técnica de secuenciación de próxima generación (NGS) se utiliza para analizar el gen CFTR en 770 individuos del centro-sur de Italia, identificando variantes asociadas a fibrosis quística (FQ). La NGS permitió detectar 77 variantes únicas, incluyendo 23 patogénicas, 33 con interpretación conflictiva (CIP), 18 de significado incierto (VUS) y 3 noveles. La técnica demostró alta sensibilidad, revelando una frecuencia de portadores del 8%  y destacando la mutación común p.(Phe508del) en el 37% de los casos. 

La NGS facilitó la caracterización de variantes complejas y novedosas, respaldada por análisis bioinformáticos predictivos. Este enfoque supera los sesgos poblacionales y mejora el diagnóstico y asesoramiento genético en FQ.

Imagen obtenida de: https://www.iocir.com/fibrosis-quistica-diagnostico-sintomas-y-tratamiento/

Referencias Bibliográficas:

1. De Paolis E, Tilocca B, Lombardi C, De Bonis M, Concolino P, Onori ME, Ricciardi Tenore C, Perrucci A, Roncada P, Capoluongo E, Urbani A, Minucci A, Santonocito C. Next-Generation Sequencing for Screening Analysis of Cystic Fibrosis: Spectrum and Novel Variants in a South-Central Italian Cohort. Genes (Basel). 2023 Aug 11;14(8):1608. doi: 10.3390/genes14081608. Disponible en: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10454170/